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    石蠟包埋技術誕生已有百年之久,FFPE樣本是醫學領域尤其是腫瘤研究領域中疾病診斷和科學研究中非常常見且寶貴的生物學材料,近年來二代測序的飛速發展也將FFPE樣本的信息挖掘提升到了前所未有的高度。然而在FFPE樣本的制備過程中,福爾馬林固定使得組織中的DNA之間、DNA與蛋白質、RNA等發生隨機交聯并使得DNA降解,石蠟包埋過程又加速了DNA降解,給下游的PCR及高通量測序帶來很大挑戰。如何從FFPE樣本中獲得高品質的核酸來滿足下游檢測十分重要。

    QIAGEN在FFPE樣本DNA純化方面積累了豐富經驗,QIAamp DNA FFPE Kit及GeneRead DNA FFPE Kit等產品受到了科學研究者的廣泛好評?,F在,我們在這兩款試劑盒的基礎上進一步升級,QIAamp DNA FFPE Advanced UNG Kit使得FFPE樣本DNA純化效率更高,片段化程度更低!請隨小編一起了解FFPE樣本DNA純化流程的注意事項和QIAGEN的解決方案。 各試劑盒的具體處理方法有所差異,通常來說,FFPE樣本的提取包括脫蠟和水化、酶消化組織、逆轉交聯,組織DNA提取幾個步驟。


    脫蠟

    石蠟包埋會阻礙消化液對組織的滲透,減弱蛋白酶K與組織接觸,影響組織消化,降低DNA得率,所以脫蠟一定要徹底!大家所熟知的有機溶劑二甲苯便是一種脫蠟液,但是二甲苯處理不僅會進一步加劇核酸片段化,切片厚度增加也會使得脫蠟效果變差,而且對人體有害。QIAamp DNA FFPE Advanced UNG Kit中使用的是非有機試劑Deparaffinization Solution進行脫蠟,對人體無害,更能保證核酸的完整性,這對于大片段的擴增非常關鍵。有必要指出的是QIAamp DNA FFPE Advanced UNG Kit只需要一片切片組織,就能純化到0.5ug的DNA,足以進行下游的NGS實驗。當然這款試劑盒也能處理多可達4mm 3 組織,即面積100mm 2 ,厚度8μm的5張切片。


    蛋白酶K組織消化

    為了將DNA與結合的蛋白質分離,FFPE樣本需要蛋白酶K消化。蛋白酶K可以消化蛋白質組分以及樣品中可能存在的任何核酸酶,這個步驟還可防止DNA發生降解。消化的時間過短,DNA的釋放不充分,導致核酸提取的得率低。QIAamp DNA FFPE Advanced UNG Kit采用兩次蛋白酶K處理,分別是脫蠟后56℃孵育1h和逆轉交聯之后65℃處理15min,可進一步提高核酸釋放率,即使是難裂解的組織樣本也不在話下!


    逆轉交聯

    如前述,FFPE樣本在制備過程中會發生不同程度的分子間交聯,這些交聯必須斷裂才能釋放出DNA用于后續分析。逆轉交聯需盡量在溫和的環境中進行以避免DNA的進一步破壞。在此步驟中,最重要的是做好逆轉交聯和DNA片段化的平衡。DNA的完整性對于FFPE來源的樣本非常重要,QIAGEN推薦在90℃條件下孵育1h,可實現基因組DNA的最佳回收。如下圖所示,在不同組織類型中檢測相同樣本66bp或500bp的DNA片段,使用QIAamp DNA FFPE Advanced UNG Kit純化所得的Ct值更低,表明核酸完整性更高,且在不同組織中的表現相對更穩定。


    有效減少人為的 C > U 轉換

    由于FFPE樣本儲存時間的延長, 樣本中存在由于脫氨基導致的C>U的改變,經過PCR或NGS文庫構建后使得C-G突變為T-A,這類突變在基因組中隨機發生,且在同一位點上的突變豐度較低,如未經有效清除這些人為干擾,在基因測序尤其是二代測序數據分析時有可能被解讀為與疾病的發生發展相關的變異,產生假陽性,因此很有必要在這些低豐度突變中區分真實突變與人為突變。

    QIAamp DNA FFPE Advanced UNG Kit含有UNG酶,在加熱解交聯后,通過去除脫氨基胞嘧啶殘基,特異性地從FFPE樣品獲得的DNA中去除人為假突變產生的尿嘧啶,可消除90%以上的低豐度突變,使假陽性風險降至最低。

    QIAamp DNA FFPE Advanced UNG Kit去除超過90%的低豐度變異,這些變異多為(保存過程中)自發的人為干擾


    組織DNA提取

    QIAamp DNA FFPE Advanced UNG Kit采用UCP MinElute硅膠膜離心柱進行純化,UCP (Ultra Clean Production) 超潔凈生產工藝生產,充分降低試劑生產過程中的污染對實驗結果的影響。最低20μl洗脫體積,是微量FFPE樣本純化的又一大福音!


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