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  • Arraystar Small RNA表達芯片

    同時定量檢測多種小RNA表達

    【字體: 時間:2021年12月06日 來源:康成生物

    編輯推薦:

      為了克服這些挑戰,Arraystar設計了Arraystar Small RNA Array 作為一種實用且有效的解決方案,以高靈敏度和準確度分析全譜small RNA,但需要的總RNA量要少得多。

    優勢

    • 同時篩選主要的small RNA類型:miRNA、pre-miRNA、tRNA、tsRNA和snoRNA
    • 提高小RNA表達檢測的標準,達到高靈敏度、特異性和準確性
    • 簡單直接的步驟確保了比small RNA-seq甚至qPCR有更好的無偏差定量
    • RNA樣本量要求低至100ng
    • 特別適合質量RNA樣本,如降解的RNA、血清/血漿等體液RNA、FFPE RNA

    介紹

    Small RNA-seq 已被用于分析 microRNA 和其他小 RNA。然而,利用small RNA-seq 測序數據來量化的小 RNA 的相對豐度與 qPCR/Northern Blot 結果不一致。例如,通過small RNA-seq 測得的 miR-143 的水平比 miR-145 高 40 倍,但通過 qPCR 或 Northern Blot 測得它們的表達水平相當 [1-3]。small RNA-seq 的不準確性主要是由于 small RNA-seq 文庫制備和數據分析過程的偏差對結果造成的誤導[4, 5],在某些情況下,與真實豐度的偏差可高達 10,000 倍[6-11]。

    SmallRNA定量檢測的挑戰

    RNA修飾的干擾

    在測序文庫構建和小RNA定量過程中,小RNA內部的修飾會嚴重干擾cDNA合成。小RNA修飾(例如 m1A、m3C 和 m1G)會阻礙反轉錄并中止cDNA復制,導致序列偏向于啟動端,最終導致構建無偏倚全長序列文庫失敗。例如,由于tsRNA TΨC 環區域中存在m1A修飾的阻礙,small RNA-seq通常識別 18nt 3'tsRNA,但遺漏了由Northern Blot檢測到的更主要的22nt tsRNA異構體(圖1)。

    圖1. cDNA構建所涉及步驟的圖示,包括潛在的偏差來源。(A) 具有不同5’端和3’端修飾的非蛋白質編碼RNA的起始池,由不同的線型示意性表示。(B) 左圖描述了在RNA 5’端連接之前的不同酶預處理,以富集不同的RNA亞型。在各自的5’端預處理后可用于接頭連接的RNA類別在每個預處理下示意性表示。右圖描述了可用于3’端(-oligo(A)或-oligo(C)尾)和接頭連接的RNA類別的亞型。(C)與RNA 5’(左)和3’(右)末端修飾以及cDNA構建的后續步驟相關的可能偏差。

    文庫擴增的偏差

    為了產生足夠的 cDNA 量進入測序儀,small RNA-seq需要對文庫進行PCR擴增 [12]。然而,RNA G/C 含量、序列組成、二級結構、RNA 長度、啟動以及反應條件會導致 PCR 產物的偏差和扭曲。也就是說,當轉錄組中的不同模板在PCR反應中一起擴增時,模板的偏好或阻滯擴增總是會導致 RNA 無法呈現真實的豐度 [13]。因此,需要多輪 PCR 擴增的small RNA-seq定量從來都不是絕對定量,需要使用正交方法進行驗證。

    采用TPM衡量small RNA表達水平的潛在問題

    TPM(Reads Per Million reads)值通常是small RNA-seq用于表示小 RNA 轉錄本的相對豐度的指標,簡單地用測到的每百萬小RNA片段做歸一化。然而,在這 100 萬次讀取中,一個小RNA的讀取計數的變化將改變所有其他RNA的TPM值,即使它們實際的絕對表達水平沒有改變。

    所需樣品數量

    對于tRNA和tsRNA測序,在文庫構建之前,目標RNA的分離和預處理需要 5-100ug[14] 的總RNA,這排除了樣本量有限的研究項目。

    Small RNA篩選的解決方案

    為了克服這些挑戰,Arraystar設計了Arraystar Small RNA Array 作為一種實用且有效的解決方案,以高靈敏度和準確度分析全譜small RNA,但需要的總RNA量要少得多。Arraystar small RNA Array 結合直接末端標記和巧妙的探針設計微陣列技術,在一張芯片上同時檢測和量化包括miRNA、pre-miRNA、tsRNA、tRNA和snoRNA在內的小RNA,為研究小RNA的調控功能和生物標志物潛力提供重要的表達信息。

    高靈敏度和特異性的探針設計精確定量small RNA

    成熟的小RNA,如miRNA和tsRNA,在生成過程中具有非隨機、精確切割的末端和確定的RNA大小。

    Arraystar Small RNA Microarray 探針旨在最大限度地提高對序列堿基和長度接近的目標RNA檢出的靈敏度和特異性。對于成熟體小RNA的探針(圖2),5'-CAP發夾結構和固定G位置的C-Cy3標記極大提高了成熟小 RNA 大小和末端的區分能力。 短的特定探針區域與雜交時的最佳探針/靶點Tm匹配。

    由于小RNA前體傾向于形成更穩定的分子內二級結構和相對較低的前體RNA水平,成熟的小RNA探針具有出色的特異性,可以區分成熟與前體小RNA。對于前體/更長小RNA的探針(圖3),被設計為特異性結合pre-miRNA、tRNA和snoRNA的特有序列。

    對于芯片收錄的miRNA、pre-miRNA、tsRNA、tRNA和snoRNA,即使只有一兩個堿基的差異,探針組也能準確檢測和量化。

    圖2. 成熟體小RNA的探針。從 5'->3',(A) 5'-Cap段形成發夾結構,以阻止較長尺寸的序列,如前體、退火異構體的結合。(B)探針雜交區第一個堿基位置的固定G與目標RNA 3'端的C-Cy3標記堿基配對,形成更穩定的GC-夾子。(C)短的~20-nt探針特異性結合區域利用最佳Tm進行標準化,以區分僅具有1~2個堿基差異的相似RNA。(D) 3'-Linker 提供了空間,防止玻片表面產生空間位阻。

    圖3. 小RNA前體探針。~20-nt短探針結合區使用前體pre-miRNA、tRNA和snoRNA的特有序列進行了Tm值優化。

    Small RNA末端直接標記

    為了對用于芯片篩選的小RNA進行熒光標記,用T4多核苷酸激酶(T4 PNK)處理總RNA,從3'端去除單磷酸(P)和環磷酸(cP)基團,暴露3-OH末端。添加二甲基亞砜(DMSO)作為變性劑,盡量減少小RNA二級結構和序列構成差異的影響。然后通過T4 RNA連接酶將小RNA與pCp-Cy3連接到3'末端。一個RNA分子被一個Cy3標記(圖4)。

    圖4. Small RNA的直接末端標記。具有3'-P或3'-cP末端的RNA用T4多核苷酸激酶(T4 PNK)去磷酸化以形成3-OH末端。添加DMSO以減少RNA結構對標記的影響。pCp-Cy3通過T4 RNA連接酶連接到RNA的3'-OH。每個RNA末端都被精確標記。

    末端標記優勢

    更好的無偏差定量  Small RNAs在其3’-OH端直接與Cy3染料連接,完全避免RNA預處理去除內部RNA修飾,由于RNA修飾和RNA二級結構導致的逆轉錄失敗,以及有偏倚的PCR擴增步驟的影響。所有這些都有助于保持Small RNA水平的保真度,并實現比RNA-seq甚至qPCR更好的無偏的高定量精度。

    RNA樣本量要求較低  直接進行RNA末端標記,沒有RNA預處理導致的RNA損失,顯著減少RNA總量需求,特別是對高度修飾的Small RNA(如tRNA和tsRNA)。Arraystar Small RNA Microarray對樣本量需求低,為樣本量少的研究提供了機會。

    質量較低的RNA樣本也能檢測  Arraystar small RNA芯片的RNA直接末端標記對底物RNA序列中的核苷酸損傷相對不敏感,因為它不依賴于逆轉錄cDNA復制。這與Small RNA-seq形成鮮明對比,Small seq容易受到Small RNA序列的任何核苷酸損傷的影響。此外,雖然芯片探針不受不相關序列存在的影響,但降解RNA樣本中豐富的rRNA片段可以污染相似大小的Small RNA,抑制Small RNA-seq中的Small RNA檢出。

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    Arraystar Small RNA 芯片列表

    服務名稱

    描述

    規格

    Arraystar Human Small RNA 芯片

    miRNAs, pre-miRNAs, tsRNAs, tRNAssnoRNAs

    8 x 15K

    Arraystar Mouse Small RNA 芯片

    miRNAs, pre-miRNAs, tsRNAs, tRNAs snoRNAs

    8 x 15K

    References
    [1] Kent OA. et al (2010) “Repression of the miR-143/145 cluster by oncogenic Ras initiates a tumor-promoting feed-forward pathway” Genes Dev 24(24):2754-9 [PMID:21159816]

    [2] Chivukula RR. et al (2014) “An essential mesenchymal function for miR-143/145 in intestinal epithelial regeneration” Cell 157(5):1104-16 [PMID:24855947]

    [3] Akao Y. et al (2007) “Downregulation of microRNAs-143 and -145 in B-cell malignancies” Cancer Sci 98(12):1914-20 [PMID:17892514]

    [4] Raabe, C. A., et al. (2014) "Biases in small RNA deep sequencing data" Nucleic Acids Res 42(3):1414-26 [PMID: 24198247]

    [5] Witwer, K. W. and Halushka, M. K. (2016) "Toward the promise of microRNAs - Enhancing reproducibility and rigor in microRNA research" RNA Biol 13(11):1103-1116 [PMID: 27645402]

    [6] McCormick, K. P., et al. (2011) "Experimental design, preprocessing, normalization and differential expression analysis of small RNA sequencing experiments" Silence 2(1):2 [PMID: 21356093]

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