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  • 雷帕霉素治療可延長雄性小鼠和水蚤的壽命和健康期

    【字體: 時間:2022年09月20日 來源:AAAS

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      發育與衰老密切相關,但以藥物為靶點的發育能否延長壽命仍不得而知。

      

    摘要

    發育與衰老密切相關,但以藥物為靶點的發育能否延長壽命仍不得而知。在這里,我們讓基因多樣的UMHET3小鼠在生命的最初45天內接受雷帕霉素治療。這些老鼠的生長速度較慢,而且在整個生命周期中都比對照組小。在不影響后代數量的情況下,它們的生育年齡被推遲。這項治療足以將中位壽命延長10%,對男性影響最大,并通過虛弱指數評分、步態速度、葡萄糖和胰島素耐量測試來幫助維持健康。從機制上講,治療組小鼠的肝臟轉錄組和表觀基因組在治療結束時更年輕。與小鼠相似,在發育過程中暴露于雷帕霉素可顯著延長小鼠的壽命大型水蚤縮小了它的體型。總的來說,研究結果表明,在發育過程中進行短期雷帕霉素治療是一種新型的長壽干預措施,它可以減緩發育和衰老,這表明在生命早期就可以針對衰老。

    簡介

    哺乳動物的進化史是一個突出的例子,說明壽命可以改變100倍以上。跨物種分析表明,物種的最大壽命與成熟時間呈顯著正相關,與體重呈正相關(1,2).與此相反,物種中較小的動物往往壽命更長,或者可以免受與年齡相關的疾病的影響,這一點在狗和人類的研究中得到了證明(6).這些聯系可以用增長率對長壽的重要性來解釋(1,2).胰島素/胰島素樣生長因子1(IGF-1)信號轉導相關的生長激素途徑或基因的敲除導致生物體從蠕蟲到小鼠的壽命延長(713),這還與體型減小有關。此外,預先選擇生長較慢的野生型老鼠比其快速成長的兄弟姐妹壽命更長(14).同樣,與壽命較短的哺乳動物相比,壽命較長的哺乳動物的生長速度較低(15).這些發現表明,生物體的生長速度、體型和壽命之間存在因果關系。

    一些間接證據支持生長信號抑制與壽命之間的因果關系,如果目標是在發育過程中。例如,生長激素基因敲除小鼠和缺乏生長激素分泌的小鼠比野生型同胞壽命高出50%(10,12).然而,如果在出生后早期接受生長激素治療,它們的壽命就會縮短(16,17).同時,在成年期誘導的生長激素敲除對壽命沒有影響(18).然而,目前還沒有任何實驗表明生長途徑只在發育過程中被直接抑制,而且壽命結果也得到了測量。

    雷帕霉素是雷帕霉素(mTOR)抑制劑的一個很好的機制性靶點,是目前最有效和最有效的延長小鼠壽命的藥物干預措施之一。雷帕霉素可以延長壽命,如果在成人期(19,20)或者以后的生活(21,22)在各種小鼠品系中,包括遺傳多樣性的UMHET3小鼠(四個近交系的雜交)。雷帕霉素不能延長生長激素受體敲除小鼠的壽命(20).此外,早期生命(EL)雷帕霉素治療曾被證明能抑制小鼠的生長(23).因此,雷帕霉素是一個很好的候選品來測試只有在生命早期才有針對性的生長是如何影響壽命的,我們在我們的研究中使用了它,考察了它對壽命、健康壽命、生物年齡和基因表達的影響。

    結果

    雷帕霉素在小鼠發育過程中的治療會減弱小鼠的生長和繁殖開始

    為了評估雷帕霉素對壽命的影響,我們建立了一個130只新生的UMHET3小鼠隊列作為壽命實驗,另一個由40只小鼠組成的獨立隊列進行健康壽命分析(圖1A).以含有42%(百萬分之42)的尤德拉吉特膠囊雷帕霉素或相應數量的包封材料作為對照,喂養有新生兒的母鼠。幼崽在20-22日齡時與母鼠分離,并繼續以相同的雷帕霉素飼料喂養至45日齡(圖1A).然后,這些動物被轉移到一個正常的飲食和跟蹤他們的余生。

    圖1雷帕霉素抑制基因異質小鼠的生長和繁殖。

    (A)雷帕霉素治療對小鼠壽命和健康影響的實驗設計。RNA序列,RNA測序。糖耐量試驗;胰島素耐受試驗。(B)2個月大的UMHET3小鼠在其生命的前45天內接受eudragit膠囊雷帕霉素或對照(含eudragit)飲食的代表性圖像。(CD)雷帕霉素對雄性(C)和雌性(D)小鼠體重的影響(n=30/性別)或對照組(n=每性別34至39)0至45天的飲食。陰影區顯示雷帕霉素治療的時間。數據為平均值±SE。(E)雷帕霉素對幼犬營養影響的實驗設計。(F)7日齡幼崽體重增加的百分比,計算方法為:食用牛奶后的幼崽體重除以6小時饑餓期后和幼崽返回母鼠之前的群體平均體重,再乘以100。由于雷帕霉素和對照幼犬之間的基線體重差異,所以將平均體重用于各組內的標準化。(G)從分娩之日起,接受雷帕霉素或對照飲食的母鼠的乳蛋白濃度。(H)繁育者在發育期間接受雷帕霉素或對照飼料所生的幼崽數量。()雷帕霉素治療組和對照組育種者懷孕間隔時間*P<0.05****P<0.0001;ns,不重要。

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    雷帕霉素治療EL導致小鼠體型變小(圖1B)在兩個雄性大鼠的整個生命周期中都保持了體重減輕(圖1C)以及女性(圖1D).雷帕霉素在幾天內就有了效果。治療結束后,患者體型較小,男性比女性更易受到影響。因此,治療組的器官(腦、肝、腎和脾)的重量也減少了(圖S1A)。

    因為雷帕霉素最初是通過乳汁給幼崽的,所以我們研究了雷帕霉素是否直接抑制動物的生長或影響營養物質的消耗。因此,我們測試了幼崽是否食用同樣數量的牛奶,以及接受治療的動物的牛奶總蛋白是否受到影響(圖1F).我們關注的是蛋白質水平,因為雷帕霉素抑制蛋白質合成(24,25).我們發現治療組和對照組的牛奶消耗量沒有差異(圖1F);每一組在從母鼠中分離出來并返回再喂養后,體重增加了相同的百分比。我們進一步建造了一個定制的擠奶泵,并從水壩收集牛奶(圖S2)。處理組和對照組的乳汁總蛋白質含量沒有差異(圖1G).我們的結論是,觀察到的生長模式的影響是雷帕霉素治療的直接后果,而不是營養缺陷。

    生長通常伴隨著性成熟的時間。為了測試艾爾-雷帕霉素治療是否不僅降低了身體生長,而且降低了性成熟時的年齡,我們建立了治療組和未治療組年齡匹配的UMHET3小鼠(46-49天大的雌性和47天大的雄性)的繁育對,并記錄了雌鼠生第一、第二胎的日期,第三胎以及出生的幼崽數量。治療組和未治療組小鼠的產仔數相同(圖1H).然而,經過處理的育種者平均比未經處理的育種者晚產4.6天(P=0.036)。在雷帕霉素治療的小鼠中,第一胎和第二胎之間的時間也更長(現在是9.6天,P=0.05),第二胎和第三胎之間的周期沒有統計學意義(P=0.5)雷帕霉素處理的育種家(圖1I).

    在小鼠發育過程中給予雷帕霉素治療可延長小鼠壽命和健康壽命

    我們發現,雷帕霉素治療可使UMHET3小鼠的中位壽命延長10%(P=0.036;圖2A).這種影響主要是由于治療對男性的影響(P=0.0064,平均壽命延長11.8%;圖2B)而雌性則沒有活得更長(P=0.55;圖2C).

    圖2在發育過程中使用雷帕霉素可以延長UMHET3小鼠的壽命。

    (A)治療和未治療的UMHET3小鼠的生存曲線,性別組合。(BC)(B)雄性和(C)雌性UMHET3小鼠從出生到45天的存活曲線,這些小鼠以雷帕霉素或包封材料作為對照。P用log-rank檢驗計算值。

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    為了了解EL治療小鼠的健康壽命是否也得到了改善,我們測量了虛弱指數(2628)年齡在20至29個月時,步速、血糖和胰島素耐受性。虛弱指數是基于對小鼠年齡相關特征的無創性評估,對小鼠整體脆弱性的31個參數進行評估(2628).雷帕霉素治療使小鼠的虛弱程度低于對照組[重復測量方差分析(ANOVA)],P=0.037;圖3A],我們觀察到男性和女性的虛弱指數得分較低,但沒有統計學意義(圖3B).我們進一步應用了脆弱指數時鐘(26)這項研究基于虛弱評分特征預測小鼠的存活率,并考慮到小鼠的年齡,發現用艾爾雷帕霉素治療的小鼠的預測生存時間更長(根據性別調整的協方差分析,P=0.015;圖3C).我們的結論是,雷帕霉素治療延遲了虛弱表型的發生,包括與小鼠存活相關的特征。特征分析顯示,治療組的前肢握力、步態障礙、身體狀況評分和腹脹得到改善(圖S3A)。

    圖3雷帕霉素在發育過程中的治療延長了小鼠的健康壽命。

    (A)從出生到45天,20-29個月大的UMHET3小鼠被喂食含有雷帕霉素或膠囊材料(eudragit)的食物,其虛弱指數得分。P用重復測量方差分析(ANOVA)檢驗計算值。(B)從出生到45天,20至29個月大的雄性(M)和雌性(F)UMHET3小鼠接受雷帕霉素或對照飼料的虛弱指數評分。P用重復測量方差分析法計算。(C)根據使用恐懼(虛弱和死亡分析)時鐘計算的虛弱指數預測生存率(以月為單位)。(D)小鼠步態速度測量方案。(E)老鼠到達終點的中間時間(秒)。P用重復測量方差分析法計算。(FG)(F)雌性和(G)雄性的葡萄糖耐量試驗結果(G)(n=每組4至6個性別)。胰島素耐量試驗結果(H)女性和()雄性(n=每組4至6個性別)。P數值計算采用重復測量方差分析檢驗。(JK)葡萄糖耐量和胰島素耐量試驗曲線下面積(AUC)。P數值是用單尾學生的t測試。

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    我們進一步開發并應用了一種新的測試來評估老鼠的活動能力,這種測試不需要特定的設備,可以通過手機和一個普通的應用程序來進行(圖3D).這種測試可以在室內設施中進行,成本幾乎為零。在這個實驗中,老鼠被放在籠子的一端,讓它們自愿跑到籠子的另一端(圖3D).完成的時間是由照片完成應用程序決定的。我們發現老鼠隨著年齡的增長跑得慢得多(圖S3B)。我們進一步證實,我們的測試結果可與廣泛使用的評估肌肉功能的測試相比較。因此,我們在同一組27個月大的老鼠身上進行了三項測試:旋轉木馬、跑步機和這里介紹的步態速度分析。我們發現我們的測試和跑步機以及旋轉木馬之間有顯著的相關性(圖S4,C和D)。雷帕霉素減弱了老年男性的這種表型(圖3E)這表明,作為干預的結果,這些動物的活動適應能力得到了更好的保存。

    此外,我們還分析了我們的EL干預是否會影響老年動物的代謝健康,是否會導致類似于急性雷帕霉素治療的葡萄糖不耐受。糖耐量和胰島素耐量試驗顯示,接受治療的老年男性的葡萄糖和胰島素耐量有一些性別特異性的改善(圖3,F至K)與治療對壽命的性別特異性相一致。

    目的:檢測雷帕霉素是否與急性雷帕霉素治療相似,引起高脂血癥(29)我們對20至22個月大的男性和女性雷帕霉素組的肝臟和血清進行了脂質組學分析。血清中檢測到3093種脂類,肝臟中檢測到3075種。EL-rapamycin對兩種組織的脂質含量的影響有限,我們觀察到女性肝臟的大部分變化,其中95種脂質水平升高,73種脂質水平下降(表S5)。總的來說,水平升高的脂質數量與水平下降的脂質數量相當,沒有偏向于甘油三酯水平的升高,這是高脂血癥的特征(圖S7,A和B)。另外,基因表達項目1在治療動物中保持不變(圖S7C);項目1對雷帕霉素急性治療引起的高脂血癥有調節作用(30).

    與成年時使用的雷帕霉素不同,EL-rapamycin并沒有上調年輕動物肝臟糖異生途徑的基因(G6Pase編碼G6pcG6pc3型,PEPCK編碼人Pck1Pck2和PGC-1α編碼Ppargc1a公司)(圖S7D)。這一發現表明,雷帕霉素對葡萄糖代謝的影響不同于雷帕霉素在成年后的作用。

    我們進一步分析了治療組和對照組20至29個月大的動物脾臟和骨髓的免疫細胞組成。我們先前建立了新的免疫系統年齡相關表型,這些表型可以預測小鼠壽命和淋巴瘤發病率[增加的B細胞大小、克隆B細胞、年齡相關B細胞(abc)和髓系偏倚](31).對對照組小鼠的分析顯示,UMHET3小鼠與C57BL/6小鼠具有相同的年齡相關表型(B細胞大小增加、髓樣傾斜、年齡相關克隆B細胞和abc的積累)。我們發現,與對照組相比,治療組小鼠的這些表型(圖S4、A、B、D和E)以及造血干細胞的百分比(圖S4C)和細胞大。▓DS4F)沒有受到影響。

    最后,對自然死亡的老年小鼠的尸檢分析顯示,常見的小鼠年齡相關疾病的發病率沒有差異(表S1),這表明,雷帕霉素治療的長壽效應不能歸因于對特定年齡相關疾病的預防。

    雷帕霉素治療誘導促長壽基因表達的變化,這種變化是以性別特異的方式隨著年齡的增長而保留的

    為了深入了解雷帕霉素方案的分子機制,我們分析了年輕(2個月)、中年(20-22個月)和老年(28-29個月)小鼠肝臟和腎臟中基因表達的變化。我們首先發現,治療引發的差異表達基因(DEGs)的數量隨著年齡的增長而減少(圖4A).然后,我們比較了對雷帕霉素反應的轉錄組變化與已知長壽干預措施和衰老誘導的轉錄組變化(即比較基因表達特征)(32).在雄性和雌性大鼠中,EL-rapamycin引發的年輕肝臟轉錄組變化與該器官的年齡相關變化相反,與長壽干預措施(終生雷帕霉素和生長激素缺乏癥)引起的轉錄組變化相似(圖4C).在男性中,與衰老特征的負相關貫穿一生;然而,在女性中,治療效果隨著時間的推移而消失(圖4C).在男性和女性中,隨著年齡的增長,EL-rapamycin效應與終生雷帕霉素治療效果之間的正相關關系消失;在停止治療后的幾天內,幼年動物的這種反應最強(圖S5C)。這表明,一旦終止治療,雷帕霉素對肝臟轉錄組的影響會隨著時間的推移而減弱。然而,在治療過的雄性小鼠中,轉錄體的其他抗衰老和促長壽作用被保留下來。這得到了與肝臟衰老特征負相關和與具有較高中位和最大壽命(中位和最大壽命特征)的小鼠基因表達生物標志物的正相關支持(圖4C).治療的性別特異性壽命和健康壽命效應反映在肝臟基因表達的變化上。特別是,從治療中受益最多的男性在不同年齡段與衰老特征之間保持負相關。另一方面,接受治療的女性在老年時與衰老特征呈正相關。

    圖4雷帕霉素在發育過程中的治療可以減緩年輕動物轉錄組和DNA甲基化(DNAm)的老化,雄性動物在整個生命周期中都會保存這些年輕的轉錄組。

    (A)年輕、中年和老年用艾拉帕霉素治療的動物肝臟和腎臟中的差異表達基因(DEGs)數量[錯誤發現率(FDR)<0.1]并與對照組進行比較。(B)在年輕(紅色)、中年(綠色)和老年(藍色)動物中,由艾爾-雷帕霉素引起的基因表達變化與雄性(頂部圖)和雌性(底部圖)衰老和壽命延長的特征之間的關聯。干預特征包括個體干預的基因特征[熱量限制(CR)、生長激素(GH)缺乏和雷帕霉素]、不同干預措施之間的共同基因表達特征(常見),以及與干預措施對最大或中位壽命(最大和中位壽命)影響相關的特征.衰老特征包括人類、小鼠和大鼠(人、鼠和大鼠)不同組織中與年齡相關的基因表達變化,以及肝臟和大腦特定的變化(肝臟、大腦)。(C)通過肝臟表觀遺傳衰老時鐘估計年輕、中年和老年治療和未治療動物肝臟的DNAm年齡。P值是用雙尾學生的t測試。(D)使用年輕治療動物肝臟和腎臟中的等級DEGs從KEGG數據庫中獲取路徑的GSEA。僅顯示至少兩種情況下的顯著富集(FDR<0.1)。根據標準化富集分數(NES)對點進行著色,并根據?日志10屬于P價值觀。(E)使用分級差異表達和(F)治療動物的差異甲基化基因。僅顯示至少兩種情況下的顯著富集(FDR<0.1)。點的顏色根據NES和大小?日志10屬于P價值觀。

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    基于分子特征數據庫(MSigDB)的途徑基因集富集分析(GSEA)顯示,幼年動物對治療反應上調代謝途徑和下調炎癥途徑(圖5D).這些變化與其他長壽干預措施一致,包括成年時的雷帕霉素、熱量限制、生長激素缺乏癥和異慢性拋物體。▓DS5,A和B),與年齡相關的變化相反。與壽命和健康的益處相一致,我們觀察到轉錄體的性別特異性影響。首先,與女性不同,接受治療的男性保持了炎癥通路隨年齡增長的下調(圖4E).其次,年輕男性比年輕女性更強烈地上調代謝途徑(圖4E).

    圖5在發育過程中接受雷帕霉素治療可延長壽命,并縮小大型水蚤.

    (A)代表性圖片D、 麥格納雷帕霉素暴露后12至14天。圖中還顯示了同一年齡段的對照動物。(B)水蚤第14-16天、第59-63天和第81-83天的體型測量。P使用雙面學生的t測試。數據為平均值±標準差。克魯斯卡-沃利斯試驗(*P<0.05**P<0.01***P<0.001****P<0.0001)。n、 不重要。(C)對照組和三種不同濃度雷帕霉素的生存曲線(對照組,n=379;0.01牛米,n=107;1牛米,n=97;0.1納米,n=63)。

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    我們進一步比較了肝臟和腎臟治療引起的基因表達變化。雄性大鼠肝臟和腎臟對雷帕霉素的反應上調核糖體基因,而女性的肝臟和腎臟則下調這些基因(圖4D以及表S3和S4)。在雄性和雌性腎臟中,干擾素-γ和炎癥反應途徑在兩種組織中持續下調,這表明雷帕霉素的一些作用可能是通過炎癥的全身效應介導的(圖S5D)。

    總的來說,我們發現雷帕霉素治療最初引發的基因表達變化與有效的長壽干預措施相似,與年齡相關的變化相反,男性在整個生命周期中更好地保持這些影響。然而,女性在老年時失去了與衰老特征的負相關,這與艾爾拉帕霉素治療對壽命和健康壽命的性別特異性影響一致。而且,老年男性和女性的基因表達水平之間沒有相關性(Spearman相關系數,r=?0.02),進一步揭示了雷帕霉素對老年動物基因表達影響的性別特異性(圖S5、E和F)。

    雷帕霉素對小鼠肝臟DNA甲基化模式的影響

    為了測試表觀基因在EL-rapamycin長期作用中的潛在作用,我們對肝臟進行了DNA甲基化(DNAm)分析,并用RNA測序進行了分析。治療顯著影響83個CpG位點[錯誤發現率(FDR)<0.1],與動物的年齡和性別無關(表S2)。我們進一步進行了基因本體論(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)對攜帶不同甲基化CpG位點和差異表達的基因的富集。年輕動物體內的這些基因在類固醇、甲狀腺和激素生物合成中顯著豐富(圖S6)。這一發現表明,雷帕霉素通過改變其DNAm模式來調節激素生物合成相關基因的表達。這與治療對身體大小和性別特異性影響的變化是一致的。

    然后我們使用pan組織和肝臟特異性表觀遺傳衰老小鼠時鐘來估計肝臟的DNAm年齡。艾爾-雷帕霉素治療最初降低了雌雄幼獸肝臟的表觀遺傳年齡,但這種效應隨著年齡的增長而消失(圖4C).年輕、中年和老年治療的男性和女性的差異甲基化區域的富集顯示了數量有限的富集途徑,這些途徑在治療后發生了變化,并且在兩性的整個生命周期中都得以保留(圖4F).此外,CpG在年齡和性別之間的相關性相對較高,僅在年輕男性和年輕女性之間(Spearman相關系數,r=0.12),在老年男性和中年男性之間(r=0.15)(圖S5F)。

    雷帕霉素在發育過程中的治療延長了大型水蚤

    為了了解雷帕霉素治療是否通過進化保守的長壽機制起作用,我們以無脊椎動物為模型D、 麥格納只有在出生后發育期間才服用雷帕霉素。我們選擇了從第3天和第4天到第11天和第12天的時間窗口,因為大多數動物在第12天開始生產后代(33).

    像老鼠一樣,艾爾雷帕霉素治療水蚤體積更小,而且效果是劑量依賴性的(圖5,A和B).而用1和10納米雷帕霉素治療的動物在整個生命周期中都保持較小的體型,水蚤用0.1nM雷帕霉素治療后,隨著年齡的增長,他們的大小逐漸變大,到83天時,與對照組沒有顯著差異(圖5B,對)。盡管這些動物在體型上趕上了,但仍然活得更長,這表明在整個生命周期中保持身材矮小并不是治療長壽的必要條件。

    超過10μM的濃度被發現是有毒的,因此沒有進一步研究。我們沒有觀察到0.1μM雷帕霉素對壽命的顯著影響(χ2=1.505和P=0.220)。然后,我們檢查了三種低劑量的雷帕霉素(10、1和0.1 nM)對壽命的影響,發現三種情況下的壽命都顯著延長(對照組與10 nM:χ2=22.72和P<0.0001;對照組與1nm:χ2=16.23和P<0.0001;對照組與0.1nM組比較:χ2=18.67和P在對數秩檢驗中<0.0001)(圖5C).

    討論

    在這項研究中,我們證明了在出生后的發育過程中使用雷帕霉素可以延長壽命,這與進化上遙遠的模式生物小鼠和無脊椎動物的生長發育延遲有關水蚤因為許多以生長途徑和體型為目標的長壽干預措施與物種內的壽命成反比,我們的研究結果提供了第一個證據,證明減緩mTOR介導的生長可以延長壽命。

    有很多證據表明,暴露在電致發光環境中可能會影響到進化距離遙遠的生物體的衰老和壽命。例如,在擁擠的窩窩模型中,獲得較少營養的幼鼠壽命更長,盡管其機制尚不清楚(34).也有一些極端情況下,通過改變昆蟲發育過程中的飲食來延長壽命。在發育過程中喂養蜂王漿的蜜蜂變成蜂王,壽命是未經處理的工蜂的兩倍多(35,36).同時也有報道稱,在發育早期,活性氧的自然增加可以延長其壽命秀麗隱桿線蟲根據H3K4me3標記(37).這些發現在小鼠身上得到了進一步證實,在小鼠發育過程中有條件地敲除Sod2可提高成年動物對隨后氧化劑攻擊的抵抗力(38).然而,以前的研究都沒有涉及到藥物干預,這使得對潛在機制的解釋變得困難。在出生后的發育過程中,暴露于雷帕霉素(一種mTOR抑制劑)會延長壽命,并抑制兩種進化上相距遙遠的有機體的生長,這一事實支持了mTOR是生物體生長的關鍵基因,它介導了生長速度和壽命之間的關系。然而,雷帕霉素也有影響生長和細胞分裂的靶點,例如,人類細胞中的信號轉導和轉錄激活因子3和c-MYC(39).未來的研究可能會測試mTOR缺陷小鼠是否對EL-rapamycin方案的反應與野生動物相似。

    EL暴露轉化為長壽表型的方式尚不清楚。一種可能是治療組織的表觀遺傳記憶由改變的染色質結構和DNAm支持。在我們的分析中,經過治療的動物一直到老年,肝臟中的DNAm幾乎沒有變化。然而,有可能的是,EL-rapamycin治療對染色質結構有長期的影響,而不是DNAm,正如最近在活體小鼠腸道中所顯示的那樣(40).另外,非肝臟的組織(這里分析)可能參與了艾爾-雷帕霉素治療的表觀遺傳記憶。

    也有可能在EL期間,壽命機制的增強足以在以后的生命中減弱衰老表型。基因表達特征和DNAm時鐘都顯示了EL-rapamycin對幼年動物壽命的影響最強,而這些影響大多在生命后期消失。駕駛員體細胞突變可能在年輕時發生,并在晚年演變成一種全面的癌癥(41).EL治療可以預防或延緩體細胞突變的出現,從而導致與年齡相關的克隆擴展和癌癥的延遲。另一種解釋可能涉及蛋白質穩態的改善。核孔復合體和組蛋白是在生命早期合成并在非復制組織中保存的蛋白質的例子(42,43).同時,最近有一個發現,雷帕霉素可以提高體外翻譯的精確度(44).雷帕霉素治療可以減少長壽命蛋白質的翻譯錯誤數量,并改善其在整個生命周期中的累積功能,即使在年輕時給予短暫的治療也是如此。未來的研究可能會測試艾爾-雷帕霉素是否在體內起作用。另一個解釋艾爾-雷帕霉素對長壽的好處可能是應激和損傷反應相關通路的短暫激活。在發育過程中誘導的活性氧的瞬時增加和有絲分裂前期與小鼠對氧化應激反應的改善和在C、 挽歌(37,38).在我們的基因表達數據中,外源性代謝和過氧化物酶體在年輕男性中被EL-rapamycin上調,這進一步表明,雷帕霉素在發育過程中激活應激反應,可以為以后的壽命帶來益處。

    雖然我們觀察到在使用艾爾-雷帕霉素后,體型明顯縮小,但其影響比生長激素途徑缺乏的侏儒小鼠模型通常觀察到的要小。如果壽命與體型的影響大小成線性關系,那么這就可以部分解釋為什么我們的研究中壽命效應比矮小小鼠。10%對40%矮小小鼠)(10,11,16).未來的研究可能會測試更高劑量的雷帕霉素是否會更強烈地阻礙發育,從而進一步延長壽命。此外,我們的研究使用了遺傳異質性小鼠,而矮小小鼠的壽命研究是在近交系背景下進行的,這也可能解釋了效應大小的一些差異。

    雷帕霉素對壽命的影響也小于擁擠產仔實驗(中位壽命增加16%)(34)它也測試了EL暴露對小鼠壽命的影響。在壽命延長方面,來自擁擠幼崽的雌性比雄性受益更多。這一發現與我們的研究不同,我們的研究中只有男性的壽命延長。這一差異可能是由于擁擠的窩窩中幼犬獲得較少的營養和EL-rapamycin的作用機制不同造成的,后者在治療組和對照組中的幼崽攝入相同量的牛奶。

    雷帕霉素的長壽效應偏向男性,而在成年期和老年期給予雷帕霉素的女性壽命比男性長(19,21).長壽干預措施在不同的時間段可能有不同的效果,例如,限制熱量攝入不能延長壽命,如果從老年開始(45)生長激素受體在成年動物中的條件敲除只延長雌性動物的最大壽命(18).需要進一步的研究來澄清這一現象。

    艾爾-雷帕霉素的性別特異性效應與先前使用生長操縱法測量壽命的研究一致。與雄性小鼠不同,雌性小鼠在成年期受益于生長激素受體的有條件敲除(18).這表明,生長激素受體敲除對女性壽命的好處是EL和晚年效應的結合,但只有EL暴露對男性壽命有影響。同樣,生長激素缺乏的男性比女性對EL生長激素療法的反應更強烈(16).對這些影響的一種解釋可能是,女性天生體型較小,因此,生長遲緩對其表型的影響較小。我們發現,雷帕霉素對雄性小鼠的生長影響大于雌性小鼠。另一種解釋可能是生長控制、性別和壽命的分子機制之間的一種重要關系。在這項研究中,我們發現,接受治療的女性起初會減少炎癥途徑,但在以后的生活中會激活它們。這表明女性在年老時積極地獲得有害功能,同時在治療后失去了促進長壽的作用。最后,在小鼠實驗中,只測試一種劑量的雷帕霉素。然而,我們水蚤實驗表明,低劑量的雷帕霉素與高劑量的雷帕霉素一樣有益,但最高濃度的雷帕霉素是有害的。未來的研究可能會探討雷帕霉素對小鼠壽命的劑量效應。

    材料和方法

    動物

    CByB6F1/J雌性和C3D2F1/J雄性小鼠從杰克遜實驗室購買。每天建立和監測育種對。在出生當天,雄性大鼠從籠子里取出,給母鼠注射5053日糧中含有相同濃度的雷帕霉素膠囊(42 ppm活性化合物)或包封材料優曲吉特(雷帕霉素控股公司),并隨意喂養至45天。然后,所有的老鼠都要接受一個5053的常規飲食(試驗飲食),并一直跟蹤到死亡或垂死狀態。死于搏斗的老鼠被排除在生存分析之外。橫斷面研究的動物用一氧化碳安樂死2.取脾臟并儲存在冷磷酸鹽緩沖鹽水中,直到分析,肝臟樣本立即在液氮中冷凍并儲存在?80攝氏度。所有使用小鼠的實驗都是按照實驗動物使用的機構指南進行的,并得到了布里格姆婦女醫院和哈佛醫學院動物護理和使用委員會的批準。

    食物消費和牛奶收集

    為了計算幼鼠的食物消耗量,將7日齡幼崽與母鼠分離6小時;對幼崽進行稱重,返回母鼠1.5小時,然后再次稱重。幼犬再喂養后體重的變化可作為攝食量的一個指標。在幼崽9和14天大的時候,從母鼠身上收集乳汁。在電動吸乳器(Toogel)的基礎上,設計了一種定制的小鼠擠奶機。用3.5%異氟烷麻醉母鼠,置于加熱墊上,腹腔注射100μl 2iu催產素(Sigma-Aldrich)于無菌鹽水中,以刺激產奶。然后將牛奶(50至100μl)收集到微管中并在?80攝氏度。用Qubit蛋白檢測試劑盒測定蛋白質濃度。

    RNA測序

    按照制造商的說明,使用Direct zol RNA Miniprep試劑盒(Zimo)從snap冷凍肝臟中提取總RNA。用50μl無核糖核酸酶的水洗脫RNA。RNA濃度用Qubit用RNA-HS試劑盒測定。根據TruSeq鏈mRNA樣品制備指南,用TruSeq鏈mRNA LT樣品制備試劑盒制備文庫。使用生物分析儀(安捷倫)對文庫進行量化,并使用Illumina NovaSeq6000 S4(2×150個堿基對)進行測序,以獲得每個樣本20 M的讀取深度覆蓋范圍。使用Illumina包bcl2fastq將BCL(二進制基調用)文件轉換為FASTQ。將Fastq文件映射到mm10(GRCm38.p6)小鼠基因組,用starv2.7.2b獲得基因計數(46).基因表達的統計分析用來自R的DEseq2 3.13和edgeR 3.34.1的定制模型進行(結果DEG列表見表S3)(47).對于GSEA,每個基因的等級計算如下?日志10(P值)如果對數折數變化為正,則乘以1?如果為負數,則為1。GSEA是用R中的clusterprofiler包執行的(48).為了進行特征關聯分析和壽命相關基因的鑒定,我們篩選出讀數較少的基因,在至少50%的樣本中只保留至少10個讀數的基因,根據Entrez注釋,結果檢測到12374個基因。

    虛弱指數

    虛弱指數的測量如中所述(26);根據原始方案計算虛弱指數得分,并進行小幅度修改。由于雷帕霉素治療的小鼠明顯小于對照組,因此體重和體溫的sd_評分根據各組年輕動物的平均值獨立計算。因此,我們避免了這些參數的偏差,因為各組之間的體型差異。

    步態速度

    老鼠被安置在一頭有自由空間,另一端有食物容器的普通老鼠籠里。記錄從SprinTimer應用程序(appstore)開始,在應用程序發出“GO”信號后,讓老鼠自愿跑到籠子的另一端。在絕大多數情況下,老鼠跑向食物容器,大概是為了躲起來。終點線用籠子末端的彩色膠帶標出。當老鼠到達終點線時,停止記錄,并根據應用程序中的圖片量化完成的時間。完成時間被確定為老鼠鼻子越過終點線的時間。讓每只老鼠跑四次,記錄中位數。如果老鼠在跑步過程中沒有站立或旋轉90°或更大角度越過終點線,則認為嘗試成功。如果老鼠在15秒內跑不完,記錄15秒。

    葡萄糖和胰島素耐受試驗

    在葡萄糖耐量試驗中,小鼠被放在無食物的籠子里16小時(通常從晚上7點到第二天上午11點)。第二天,給小鼠稱重、標記,并從尾部出血,用血糖計測量空腹血糖水平。將過濾后的10%葡萄糖注入無菌生理鹽水(Sigma-Aldrich)中,最終劑量為1mg/kg體重。在小鼠之間每隔30秒注射一次。在注射后20、40、60和120分鐘,每隔30秒再次測量血糖水平。同樣進行胰島素耐受試驗,但小鼠禁食6小時(通常從上午10:00到下午4:00),并注射胰島素(0.75 U/kg;禮來)在無菌鹽水溶液(Sigma-Aldrich)中。

    DNA甲基化

    我們用最近開發的哺乳動物甲基化陣列(Horvathmammalmethchip40)分析了從肝臟分離的DNA樣本(49).在我們的分析中使用了兩個時鐘,其中一個基于小鼠肝臟(肝臟)的時鐘,另一個是基于pan組織的時鐘(pan)(50).學生的雙尾t檢驗用于統計學檢驗。對于GSEA,每個CpG站點的第一等級計算如下?日志10(P值)如果對數折數變化為正,則乘以1?如果為負數,則為1。然后,按基因名進行等級聚合,計算每個基因的平均秩值。為了比較起見,只有在差異表達分析中包含的基因才被納入DNAm-GSEA。對于GO和KEGG富集,具有位點的基因因處理而顯著改變(P<0.05)與DEGs重疊(P<0.05),并使用clusterprofiler軟件包的enrichGO和enrichKEGG函數,以微陣列檢測到的所有基因為背景,對重疊基因進行富集分析。

    水蚤存活

    D、 麥格納動物被用于水蚤壽命測定。從瑞士巴塞爾大學的埃伯特實驗室獲得了一個IL-MI-8耐熱克隆,該克隆來自以色列耶路撒冷的一個池塘。為了收集同步隊列,將出生于1-2天的新生兒與母親分開,在第8-10天確定其性別。所有母親在相同的條件下(25°C)喂養和培養。在這項研究中,我們所有的實驗都使用女性。藥物治療后,將40至50只動物隨機分配到我們開發的培養罐中(51).所有培養物(例如母親、新生兒和水箱培養物)都保存在亞當水里(52)在25°C的培養箱中,暴露在16個光小時后8個黑暗小時的光周期中,每天喂綠藻懸浮液,斜斑,濃度為105細胞/ml(對于一只動物/20ml密度,按人口比例分配的食物量)。每隔6天,換一次水,人工將后代移走,直到將動物轉移到培養平臺上。culture platform操作協議的細節與先前發布的協議中的類似(51).

    單調的工作

    小鼠被放置在跑步機的一條車道上,并被要求跑至筋疲力盡(不超過15分鐘);這次被記錄下來了。老鼠被強迫在跑步機的一端使用一個震動線圈(頻率設置為4赫茲,強度為1毫安),如果他們把自己抬到跑步機的一端,這些動物就能感覺到。一個早期的終點是當老鼠變得如此疲勞以至于他們選擇被電擊而不是在跑步機上跑步。這是在老鼠閑置5秒后,將老鼠從跑步機上移開并讓其休息的情況下確定的,跑步機速度設定為7.5米/分鐘。

    旋轉法

    將小鼠置于旋轉木馬裝置上最多15分鐘。在試驗期間,小鼠在旋轉木馬上行走并保持平衡。試驗前,小鼠以8rpm的轉速馴化5min,靜置1小時,以2rpm的起始轉速,以2rpm/s的加速度進行試驗。每只老鼠測試一次。記錄了墜落的時間。

    脂類學

    使用液相色譜-質譜(MS)系統對極性和非極性脂類進行分析,該系統由島津Nexera X2 U-HPLC(島津公司)和Exactive Plus orbitrap質譜儀(Thermo Fisher Scientific)組成。使用Qiagen組織分析儀以1:20質量體積比(mg/μl)在1:20(v/v)的水:異丙醇溶液中均勻化肝臟。在20赫茲下均質4分鐘后,勻漿在10000 rcf(相對離心力)下離心10分鐘前培養1小時。注入上清液(2μl)進行分析。血清樣本(10μl)提取用于脂質分析,使用190μl含1,2-二脫氧甘油-3-磷酸膽堿(Avanti極性脂質)的異丙醇作為內標。離心后,將2μl上清液直接注入100 mm×2.1 mm、1.7μm ACQUITY BEH C8柱(水)。用80%流動相A(95:5:0.1 v/v/v 10 mM醋酸銨/甲醇/甲酸)等比例洗脫1 min,然后在2 min內與80%流動相B(99.9:0.1 v/v甲醇/甲酸)線性梯度洗脫,7 min后線性梯度至100%流動相B,然后在100%流動相B下3 min。質譜分析采用正離子模式下的電噴霧電離,在70000分辨率和3-Hz數據采集率下,使用200-1100質量/電荷比進行全掃描分析。其他MS設置如下:鞘氣,50;在源碰撞誘導的離解中,5ev;掃氣,5;噴霧電壓,3kV;毛細管溫度,300°C;S-鏡頭射頻,60;加熱器溫度,300°C;微掃描,1;自動增益控制目標,16;最大離子時間,100毫秒。原始數據處理使用TraceFinder軟件(Thermo Fisher Scientific)進行目標峰積分和人工審查已識別脂質子集,并使用Progenesis QI(非線性動力學)進行峰值檢測和已知和未知脂質的積分。在與參考血漿提取物進行比較的基礎上確定脂質特性,用脂酰鏈中碳的總數和脂酰鏈中雙鍵的總數來表示。

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